影片开头承接了游戏《雷顿教授与最后的时间旅行》的情节，教授成功地使塔楼内的大钟重新报时，钟楼的巨门打开后，雷顿教授和路克发现他们正站在伦敦大本钟塔顶。
路克相当羡慕雷顿教授的风度，尤其是在说“那个人就是你”这句名言时的样子。于是他在书房里反复练习这个动作，结果一转身，刚好指到走进书房的教授，非常尴尬。教授给路克听了一首歌星杰妮丝·卡托伦的歌，这就是教授与路克最初的解谜之旅。
进入正题，杰妮丝给雷顿教授写了一封信，告诉教授她一年前病逝的好友米丽娜·维斯拉，作曲家奥兹罗·维斯拉的女儿，竟然以一个7岁小女孩的身份复活了，并声称她获得了“永远的生命”。随信还附两张歌剧门票——这是将由杰妮丝主演的、维斯拉十年磨一剑的歌剧《永远的王国》，并将使用新式乐器Detragon——类似管风琴，可用一人之力奏出整个管弦乐队的音色——来演奏。这部歌剧内容与传说中的不老不死王国安布罗西亚关系很大，雷顿教授的老师修雷达博士也参与这项研究。
蕾米将教授的小车开的飞快，把后座的路克颠得够呛。克朗·白格尼歌剧院据说是按照安布罗西亚的样子建造的，位于海边平台上。歌剧非常精彩，但大家都听得心不在焉，鼓掌的唯有教授和路克。正当两人疑惑时，舞台上出现一假面男，告知大家有关“永远的生命”的竞逐规则。一听说角逐“永远的生命”失败需要以自己的生命为代价时，出现了大骚动，许多人争先恐后想逃出剧场，然而，歌剧演员中竟有一大半都是假面人的手下！地板打开，试图逃跑者全掉了下去。突然，格罗斯基警部冲上舞台，给假面人带上了手铐，将他逮捕。结果假面人的身体像气球一样越涨越大，带着警官一同飞了出去。同时，天花板被打开，歌剧院变成了一艘大船！
大家急切不已。有人试图跳海，却发现水中有鲨鱼！船上到处慌乱不堪，唯有底层甲板上，妮娜（即“复活的”米丽娜）独自哼着一首叫“海之歌”的曲子。格罗斯基警部与鲨鱼搏斗，奋力冲上船，听到妮娜的歌声却不见人影，以为她落水了，赶紧寻找。同样镇静的还有维斯拉，他不顾人们不满弹奏起音乐，妮娜一听到音乐声立刻将警部踢飞。格罗斯基警部再次落水。
谜题001——最古老的东西
这时，广播要求大家聚集在“最古老的东西”下面，并给出了一首曲子的时间限制。多数人选择了剧场大厅外摆放的一些化石等。教授则带领路克、杰妮丝留在大厅。原来，最古老的东西正是大厅上方的天空。大厅外的地板打开，外面的人全掉了下去。这时，又一道谜题出现了。
谜题002——最大的王冠
这艘船上有许多王冠装饰品，短时间内比较它们的大小不太可能，也就是说，装饰品只是误导。路克认为最大的王冠是剧场入口处的标识。虽然并未完全说对，但是巴格兰特等人从中想到了答案，计划故意不告诉他人，这样可以减少竞争压力。不过雷顿教授还是想到了，教授一行乘坐救生艇离船。在甲板上，妮娜、维斯拉与教授相遇，教授注意到妮娜似乎有意疏远他。妮娜要杰妮丝不能让教授获胜，杰妮丝感到疑惑。救生艇渐渐驶远，大家发现船本身竟是王冠形的——这就是最大的王冠！此时，两艘救生艇上共有12人。
格罗斯基警部再次爬上船，当他正得意时，船开始爆炸。警部被迫再次跳下船，第三次落水。在水中，他发现两艘救生船朝不同方向驶去（一艘运载着掉下地板的观众回英国，另一艘运载着Detragon前往安布罗西亚）。
在伦敦
蕾米进行着调查，她找到了妮娜的父母了解情况。又找到修雷达博士，得知歌剧院观众失踪后，卷起安布罗西亚的地图立即驾驶飞机前往。中途还搭救了格罗斯基警部。
回到教授那里，他们来到一个岛上，石壁上刻着安布罗西亚的完全纹章，毫无疑问，这个岛就是安布罗西亚！岛上还有一桌美食。尽管心存疑虑，但他们还是饱餐一顿。但是休息时间很快结束，因为……狼群来了。
谜题003——渡河并躲避狼群
大家只好向树林方向跑。唯一有可能彻底摆脱狼群的只有路克，因为他能与动物交流。然而狼群似乎受到了控制，根本不听路克的。到了河边，大家发现树上有三个笼子。教授别出心裁，选择用笼子套住自己，阿姆莉他们仿照教授，做出了同样的选择。船长他们则试图套住狼，却没有成功，只好爬笼子上。原来这才是谜题的答案：用笼子套住自己，远远比套住狼更容易和安全。然而教授他们却摔了一跤，再次被狼追赶，跑进一间小木屋。阿姆莉一行人顺利渡河。至于操作错误的那几位，也就被淘汰出局。木屋里有木桶、电扇等和一些工具。教授立即动手做了一架小型飞机（够有创意的！），成功渡河并迫降。此时，这一切都在迪斯科尔的监控中。大家来到了黑色城堡的平台。
谜题004——国王的寝宫
平台上写着K、I、H、G四个字母，每两个字母间有一扇门。这回想出来的是路克，在K、G间填上IN（进入里面）即为KING（国王）。所以走K、G间的门。教授对于这个“永远的生命”的游戏起了疑惑，他决心调查真相，于是他走进了另一扇门。刚走进塔楼地板就打开了，有两个人掉了下去。教授爬上来，开始了调查。
路克、杰妮丝、阿姆莉等人走进国王卧室，突然，两道铁栅栏把他们关住了。迪斯科尔指挥手下抓走了阿姆莉。
与此同时，教授走进另外一间卧室，发现了许多关于米丽娜的照片，还有钢琴上一首名为《海之歌》的曲谱。教授发现了妮娜。妮娜转身就跑，却被教授的琴声镇住了。雷顿教授发现妮娜思维混乱，说话前后矛盾。
一大群假面人押着其余三人在城堡里走。杰妮丝和路克对视一眼，把两个押送的假面人打昏，留下那个业余历史学家呆在那里。路克和杰妮丝打算逃跑，却被前后围困，一个假面人揪起路克把他甩了出去，谁知路克竟被刚刚赶到的蕾米小姐一把抱住。格罗斯基警部也赶到了，大家开始跟假面人对打。教授带着妮娜赶到。
维斯拉准备开始对阿姆莉授予“永远的生命”，迪斯科尔给Detragon插上了钥匙，维斯拉不由分说把阿姆莉按在椅子上。雷顿教授赶到，喝令维斯拉住手。他指出：永远的生命就是空头支票，授予“永远的生命”其实无异于剥夺人的生命。Detragon其实是存储复制记忆的恐怖机器！维斯拉想保存女儿的记忆，于是便用Detragon疯狂复制记忆，而幕后黑手，正是迪斯科尔！
维斯拉几乎崩溃，完全丧失理智的他干脆把Detragon的头盔安到了路克头上，可是机器无法启动——钥匙被拔了，而拔钥匙的人是杰妮丝，其实，应当是借用杰妮丝身体的米丽娜！杰妮斯将意识退缩，允许了米丽娜的存在。维斯拉震惊万分，米丽娜则劝说父亲不要如此复制记忆。
突然，迪斯科尔冲向米丽娜，将她带到Detragon旁，原来他的目的是安布罗西亚的复活！根据安布罗西亚的完全纹章，他认为星之歌、海之歌融为一体，安布罗西亚便能复活，而米丽娜是唯一能够正确唱出海之歌的人，因此，米丽娜至关重要。维斯拉非常愤慨，这时狼群将大家团团围住。米丽娜被迫唱起海之歌。海面上一阵震动，但安布罗西亚没有复活。迪斯科尔愤怒之极，将Detragon变成一台超级机器人，打算用暴力强行找到王国。米丽娜被吊在半空中，处境危险。雷顿教授和路克迅速驾驶飞机起飞。路克跳下飞机营救了米丽娜，然而为了掩护他们，雷顿教授的飞机被击中爆炸。
雷顿教授爬上迪斯科尔所在平台，凭他精湛的剑术与迪斯科尔击剑对抗。雷顿教授告诉迪斯科尔，安布罗西亚的复活需要从另一个角度看纹章，即《太阳之歌》。他成功复活了安布罗西亚！迪斯科尔与雷顿教授扭打起来，迪斯科尔掉下了机器人。教授、路克、米丽娜逃出火海，Detragon随后爆炸。
米丽娜最终离开了杰妮丝的身体，她认为，思想一定会永远留存。维斯拉悲痛万分。格罗斯基警部准备逮捕维斯拉。维斯拉决定用Detragon尚还完好的乐器部分再弹一曲。杰妮丝优美的歌声和Detragon雄厚壮丽的琴声相融，令人久久回味。日出了，安布罗西亚沐浴在金色的光芒中，王国崭新的历程开始了。
雷顿教授与永远的歌姬的剧照
Professor Hershel Layton 艾尔夏尔·雷顿教授 (大泉洋
): 就职 于伦敦Gressenheller大学（虚构的学校）的考古学教授，嗜好红茶。他是一位热心的解密者，以英国绅士自称。虽然不是侦探，但是没有他不能解决的神秘事件。Luke Triton 少年路克·特莱顿 (
堀北真希
): 自称是雷顿教授的首位弟子。路克一直跟在教授左右，并向教授学习。特技是和部分动物交流。Emmy Altava 蕾米 ( 相武纱季): 雷顿教授正式的助手，知识丰富，性格强悍，面容姣好。此外在格斗技和汽车驾驶上颇有造诣。
Jean Descole 迪斯科尔( 渡部笃郎): 假面男，天才科学家。通过空头支票就把大家吸引到自己“解密游戏”中的反派，让众人用生命作为赌注，来争夺唯一的“永远的生命”。此人与雷顿教授似乎有着千丝万缕的关系。
Inspector Clamp Grosky 格罗斯基警部( 大冢芳忠): 苏格兰场的警部。正义感很强的热血男人，却不擅长推理。似乎生命力很强。
Odlaw Whistler 奥兹罗·维斯拉 ( 家弓家正): 富有的歌剧作者。类似管风琴的神奇乐器Detragon的发明者兼演奏者。米丽娜之父。
Melina Whistler 米丽娜·维斯拉 ( 折笠富美子): 奥兹罗的女儿，杰妮斯最好的朋友。1年前去世，但是如今却以小女孩的模样复活，并声称拥有了“永远的生命”……
Jenis Quatlane 珍妮丝 (
水树奈奈
): 知名歌剧女演员。声音优美的美女，也是这次事件的委托人。和永远的歌姬有着某种联系。本剧主题曲也是由杰妮斯的CV水树奈奈献声。其他角色
Curtis O'Donne ( 饭冢昭三): 传奇般的船长。希望获得永生来永远航海。
Mark Broshiv ( 三宅健太): 业余历史学家。希望获得永生来解决所有历史迷题
Emily Ruth 阿姆莉( 丰口惠美): 才色双绝的高中女生，全英象棋冠军。希望用永生来救病重的爷爷。
Freddy Bagased 巴格兰特( 中田让治): 大企业的社长。医生诊断只剩6个月寿命。希望用永生来逃过死亡。
Annie Doretchi 阿尼·多雷齐(
LiLiCo
)：英国著名女作家，希望能永远地写小说。Misha Leidori 雷德利( 井上喜久子): 妖艳的模特。希望获得永生来永远漂亮，永远17岁。
Pierre Starbuck 皮耶罗·斯特博古( 山寺宏一) : “传说的左脚”，因为腿伤而退役的球星。希望获得永生来重返赛场。
1.路克：“掌握着这一不可解问题钥匙的人……那个人就是你！（指着书房各处，然后思考中，这时教授进入房间）那个人就是你！（刚好指到教授，然后慌了）啊，所以还要打扫这里这里还有那里……”
2.（蕾米开车中，把路克颠的够呛）路克：“喂，蕾米小姐，小心一点啊！”蕾米：“如果你想成为教授的助手的话，就一定要习惯这样的情况。明白了吗，助手2号君？”路克：“助手2号君？！我才不是助手呢！我是雷顿教授的弟子！而且还不是一般的弟子——是第一弟子！”蕾米：“获得教授公认了吗？”路克：“（慌了）啊……当然啦……”
3.格罗斯基警部：“（爬上船，冲着海里鲨鱼整理发型）又做了次很好的运动啊。我的苏格兰场魂是不败的！正义必胜！！！（正当他在摆POSS时，船开始爆炸了，他只好又跳回海里）”
4.皮耶罗·斯特博古：“（压低声音，咬牙切齿）永远的生命对我来说是必要的——为了让这只脚复原！”
5.杰妮丝：“真不好意思，雷顿教授，居然把你也卷进来了。”教授：“没关系，帮助发愁的女性是我的义务——作为英国绅士嘛。”杰妮丝：“果然是雷顿教授风格的答案！”
6.（被狼群追赶1）阿尼·多雷齐：“我快跑不动了！”巴格兰特：“那你不是还在跑么，顽强的婆婆！”
7.（被狼群追赶2）路克：“还要跑吗……教授？”教授：“权当做运动了，出出汗，英国绅士偶尔也会这样。”
8.（一假面人揪起路克，把他往边上一甩，结果路克被蕾米抱住）蕾米：“久等了，助手2号君！”路克：“是第一弟子！”格罗斯基警部：（对假面人出示警官证）“我是苏格兰场的格罗斯基，你们全都被逮捕了！”
9.迪斯科尔：“真是不错，雷顿。你是什么时候觉察到我的存在的？”教授：“预想很早就有了，但当我看到这座充满恶趣味的黑色城堡时，我才证实了我的猜想，迪斯科尔！”
10.（在自制飞机上）教授：“就要着陆了，你们赶紧抓紧了，抓哪里都好！”路克＆杰妮丝（米丽娜）：“是！（同时抓住教授）”教授：“不行不行，我还要操作……”（飞机迫降）迪斯科尔：（在监控屏后面）：“欢迎你来到我的城堡，阿尔夏尔。”
11.（还是在自制飞机上）路克：“我要去救米丽娜小姐！”教授：“不行，太危险了！”路克：“相信我，教授！我，就是未来的英国绅士！”
12.路克：“雷顿教授，米丽娜小姐是安布罗西亚女王的转生也说不定呢。”教授：“有可能是这样的啊，路克。王国现在终于从沉睡中醒来，新的时间开始了。因为女王的，永远的歌姬的灵魂，归来了。”
雷顿教授与永远的歌姬 海报
L EVEL5的大人气NDS解谜游戏“雷顿教授”三部曲已全部上市，这款将悬疑故事结合智力谜题解答的作品既叫好又叫座，因此公司决定拍摄首部“雷顿教授”电影，并命名为《雷顿教授与永远的歌姬》，这部动漫电影预定在2009年12月19日公映。一方面，游戏不仅制作精良且所涉猎的谜题广度和深度让玩家大呼精赞，另一方面，游戏还邀请了多位知名声优担任配音。
