流式细胞术测ros图谱怎么分析
ROS的流式检测
活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。
一、注意事项
1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
二、使用说明
1、装载探针
对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激
时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
2.、检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。
4、其它说明
阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
流式细胞术的背景历史
1934年，Moldavanl首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想。1953年Crosland-Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作液层。这就奠定了现代流式细胞术 中的液流技术基础。1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数计数的主要历程。现代FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：（1）细胞的组分是可以用光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之剑存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Glhde和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色。
