新一代测序原理及意义是什么
新一代（第二代）测序技术的测序原理是“边合成边测序”。
先把基因组打断成100kb左右的小片段，每个片段单独测序，测完以后依靠大型计算机进行拼接，所以新一代测序仪测序简单，难在拼接。
测序时，以待测DNA片段为模板，进行互补链的合成，每延伸一个碱基就进行一次激光扫描，读出是哪种碱基（四种碱基事先进行不同标记，在激光下呈现不同颜色），很方便地就完成了测序。
高通量体现在一次上机能测的样本数，第一代测序仪一次上机仅能测96个样本，第二代测序仪一次上机能测数万个样本。
操作简单体现在机器自动化。
新一代测序的意义，是实现了高通量、低成本、快速、操作简便，为开展大规模物种测序及人类基因组研究提供了可能。
一代测序原理及步骤
一代测序仪利用Sanger测序——双脱氧末端终止法的原理，将被荧光标记的ddNTP掺入到dNTP中，由于ddNTP随机掺入，PCR产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddNTP。由于ddNTP缺乏链延伸所需要的3'-OH，链的延伸就选择性地在G、A、T或C处终止。这样的PCR产物与普通PCR不一样，不能形成一条电泳带，而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。1. 应用范围:① De Novo测序② 重测序: 如突变检测、SNPs、插入、缺失、克隆产物验证、比较基因组③ 分型: 如微生物和真菌鉴定、HLA分型、病毒分型④ 其它: 如甲基化分析（重亚硫酸盐测序）和SAGE（基因表达串联分析）方法2. 临床应用肿瘤突变基因的检测和肿瘤个体化治疗
高通量测序介绍
高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation” sequencing），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的 分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 发展历程 第一代测序：20世纪80年代中期 传统的化学降解法、双 脱氧链终止法以及在它们的 基础上发展来的测序技术统 称为第一代测序。它在分子 生物学研究中发挥过重要的 作用，如人类基因组计划 第二代测序：2005年开始 主要包括罗氏454公司的454测序技术、Illumina公司的Solexa测序技术和 Life Technologies公司的Ion Torrent测序技术 。第二代测序技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序 第三代测序：2008年开始 第三代DNA测序技术是以单分子测序为特点，如Helico BioScience公司的单分子测序仪，以及正在研制的太平洋生物科学公司的单分子实时DNA测序技术和牛津纳米孔技术公司的纳米孔单分子测序技术等 目前常说的高通量测序是指用第二代测序技术来进行测序 第三代测序技术（单分子测下），读长较长，错误率较高，成本较高。 NGS测试平台比较 常用名词解释 Reads： 高通量测序平台产生的序列标签就称为reads Ref： 参考基因组序列 测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。 覆盖度：测序获得的序列占整个基因组的比例。 SNP：单核苷酸位点变异 个体间基因组DNA序列同一位置单个核苷酸变异(替代、插入或缺失)所引起的多态性。不同物种、个体基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。人基因组上平均约每1000个核苷酸即可能出现1个单核苷酸多态性（SNP：single nucleotide polymorphism）的变化，其中有些单核苷酸多态性可能与疾病有关，但可能大多数与疾病无关。SNP是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。 SNV: 在研究肿瘤基因组时，相对于正常组织，肿瘤中特异的单核苷酸变异是一种体细胞突变（somatic mutation），称做SNV（single nucleotide variants） INDEL ： 基因组小片段（＜50bp）插入（INsertion）或缺失（DELetion） CNV（Copy Number Variation,CNV）:拷贝数据变异 基因结构变异（StructuralVariant,SV）的重要组成部分，由基因组发生重排而导致，一般指长度为1 kb以上的基因组大片段的拷贝数增加(gain)或者减少（loss）。如图A为loss ， B为gain 。 SV（structure variation）：结构变异 指在染色体上发生了大片段的变异。主要包括染色体大片段的插入（如图a）和缺失（如图b），染色体内部的某块区域发生翻转颠换（如图d，e），两条染色体之间发生重组（如图f）等。虽然SVs的数量远低于SNVs和indel，但SV影响的碱基更多。文献表明，多达13%的碱基受SV变化的影响。SV与疾病风险和表型变异高度相关。
高通量测序技术简介
高通量测序技术 （High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing technology），或大规模平行测序（Massively parallel sequencing，MPS）。区别于传统Sanger（双脱氧法）测序，能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术，通常一次测序反应能产出不低于100Mb的测序数据。
高通量测序技术主要还是基于二代测序来进行检测的。二代测序的目的是检测核苷酸(ATCG)序列。
测序技术推进科学研究的发展。高通量测序技术已经开始覆盖越来越多的科研领域，随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和 分子育种 奠定基础；对有参考序列的物种，进行 全基因组重测序 （resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。在 转录组 水平上进行全 转录组测序 （whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、 编码序列 单核苷酸多态性 （cSNP）等研究；或者进行 小分子RNA 测序（small RNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上，与 染色质免疫共沉淀 （ChIP）和 甲基化 DNA 免疫共沉淀 （MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。
参考链接：
高通量测序_百度百科 (baidu.com)
医疗器械生物学评价，目前国内外的情况如何
所有与人体相接触的医疗器械或物品，都需要做生物学评价，国外的控制更加严格，必需有相关的实验报告以及认证认可、声明等等才能上市。国内的审评中心也会要求按照标准进行审评，检测方面主要在济南医疗器械检测中心进行检测，他们是国际标准化组织在国内对口的秘书处单位。济南检测中心生物室也提供这方面的咨询。但是一般电话占线，方便的话可以去当面请教，他们的态度很好。
第一类医疗器械 生物学评价
一类医疗器械在注册过程中一般在市局进行，注册过程中提交自检报告就可以，但具体的检测项目要看你公司制定的相应产品注册标准的要求，即：标准中要求的检测项目是什么就检测什么。
至于生物学评价和生物学实验的关系可以这样理解：生物学实验就是按照相应实验方法的标准通过实际做试验的手段对相关生物学性能进行测试。生物学评价是指通过多种手段对其生物学性能进行评估，可以通过生物学实验也可以不做生物学实验通过标准、文献等资料论证。
基因测序的步骤是什么?
PCR产物直接测序技术现已成为分子生物学和基因组学研究中的一个重要技术,广泛用于基因突变检测、遗传性疾病诊断、单核苷酸多态性研究、基因组重叠序列群等.与传统克隆测序技术相比较,直接对PCR扩增的DNA进行测序,省去了耗时的克隆步骤,避免了传统的细菌培养,模板提取等重复性操作,可以从少量的原始样品中得到正确的DNA序列信息.PCR产物直接测序技术具有快速、简便、稳定经济的优点.
试验试剂
PCR扩增的双链DNA模板
长约20个核苷酸的DNA引物
DNA聚合酶
测序胶
0.1mol/L DDT
α-32P-dATP
dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L)
dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L)
测序反应缓冲液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl
终止缓冲液：95% 甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚蓝,0.05% 二甲苯腈
试验步骤：
1、 4个微量离心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC温浴5min,备用.
2、 在一个空的微量离心管中加入1pmol的PCR扩增双链DNA,10pmol测序引物,2μl 5×测序缓冲液,加双蒸水至总体积10μl,96OC加热8min,冰浴泠却1min,4OC 10000g离心10s.
3、 加入2μl预冷的标记混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,测序酶2U,加水至15μl,混匀后置冰上2min,标记新合成的DNA链.
4、 在第1步骤的4个管中各加入3.5μl标记反应混合物,37OC温浴5min.每管各加入4μl终止液.
5、 样品在80OC的水浴中热变性5min,每一泳道加2μl 加到测序胶上,电泳分离这些片段.
注意事项：
1.?PCR产物要有一定的长度(>200bp),因为测序结果两端20-30bp的电泳峰图的准确性较低.
2.?纯化PCR产物可通过离子交换层析使扩增的DNA段与反应剩余的dNTP及引物分离；也可通过琼脂糖凝胶电泳,将PCR产物与非特异性扩增产物和引物分离开来；如果扩增的特异性较高时,可直接通过酚：氯仿抽提,乙醇沉淀的方法来纯化.
3.?测序引物设计原则类似于PCR引物设计,可在DNA合成仪上合成20个左右的核苷酸作为引物,经过高压液相层析或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后,即可用作测序引物.
PCR循环测序法
PCR循环测序法是将PCR扩增和核酸序列分析技术相结合,从而形成的一种测定核苷酸序列的研究方法,也称作线性扩增测序.该方法采用PCR仪加热使DNA模板变性,在TaqDNA聚合酶作用下,以温度循环模式在模板上进行多轮的双脱氧核苷酸测序反应,线性扩增标记的DNA分子.
PCR循环测序法与以往的测序方法相比,其优点在于：大大减少所需的模板量；能提高测序反应产生的信号,降低了操作的复杂性,且聚合酶的用量减少；可在小量制备的模板上进行筛选反应；高温下进行的测序反应使DNA聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域；双链闭环DNA可以直接作为反应模板应用,不用作预先碱变性处理.由于PCR循环测序法能够简单、快速地检测特定序列,因此, PCR循环测序法在核酸序列分析研究中受到广泛的重视.
试验试剂：
DNA测序试剂盒
dNTP
ddNTP
丙烯酰胺
双丙烯酰胺
尿素
TEMED(N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺)
过硫酸铵
6%测序胶：6%丙烯酰胺,7mmol/L 尿素,1×TBE.
10×测序缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明胶,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP
终止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L)
终止缓冲液：95%甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈
试验步骤
1、 4个小离心管,每个小管加入3μl的终止混合液,将管子放在冰上.
2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×测序缓冲液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加双蒸水到30μl彻底混匀,每管7μl加入上面4个小管中.
3、 反应液上加30μl的石蜡油.
4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30个循环,可根据具体的情况进行适当的调整循环条件及循环次数.
5、 反应结束后在油层下加入5μl的终止缓冲液并用加样枪混匀.
6、 上样前将样品在大于80OC的水浴中热变性5min,每一道加2μl加到测序胶上,电泳分离这些片段.
注意事项：
1、 制备测序模板：PCR 扩增的产物可以经过低熔点的琼脂糖凝胶电泳纯化回收后,用于序列分析；可经过柱层析纯化,去除PCR 反应后剩余的dNTP和引物后,用于序列分析.PCR 产物也可不经纯化直接用于测序,但是这种测序产生的结果较差,建议测序之前应进行PCR产物的纯化.各种标准的质粒制备方法所纯化出的质粒均可作为测序模板使用.用标准方法制备的M13噬菌体、粘粒、λDNA都适合用作测序模板用.但要注意的是反应体系中不应有与引物互补的非目的基因序列,否则将会导致测序实验的失败.
2、 测序引物：测序引物是指合成的与测序模板链特异性互补的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5‘端进行标记,反应体系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的标记引物；也可用α-32P-dATP标记新合成的DNA链.引物的浓度不宜高,否则容易形成引物二聚体,或产生非特异性的扩增引物.
3、 酶：各种缺乏3‘—5‘端外切活性的耐热DNA聚合酶都可以用于循环测序,其中TaqDNA聚合酶在DNA测序中最为常用.虽然应用PCR循环测序法能够简单、快速的进行基因序列的测定,但仍未能适应大规模DNA序列测定的需要,而PCR循环测序法、荧光标记和自动测序仪的联合使用成为大规模基因组测序的主要技术.该技术是采用荧光标记引物或双脱氧核苷三磷酸,反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,经特定的DNA序列分析仪和分析系统处理待测的DNA序列.它的应用减轻了DNA序列测定的工作量,提高了测序的效率.
