原代培养的细胞原代培养
一、原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。二、仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：胎鼠或新生鼠试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒三、操作步骤（一）胰酶消化法1.器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取组织，置平皿中。2.用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3.用手术剪将组织剪成小块（1mm3），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4.视组织块量加入5-6倍体积的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。5.加入3-5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。6.静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。7.1000rpm，离心10分钟，弃上清液。8.加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。9.加入培养液1-2ml（视细胞量），血球计数板计数。10.将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。（二）组织块直接培养法自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。于37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。四、注意事项1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。五、无菌操作的几个注意事项1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。6、吸溶液的吸管等不能混用。附：Hank’s液配方：KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。
细胞原代培养和传代培养的区别
细胞原代培养和传代培养的区别
原代细胞(primary cell) 是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。在人工条件下使其原代细胞生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞株(cell strain) 是通过选择法或克隆形成法从原代培养细胞中获得具有特殊性质或标志物的细胞称为细胞株。一般认为，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。
什么是细胞转染
转染(transfection)指真核细胞由于外源遗传物质掺入而获得新的遗传标志的过程。如果掺入原核细胞叫转化，使用病毒作为载体的叫感染。
若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达，称“瞬时转染(transient transfection)”；若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制称“稳定转染(stable transfection)”。………………
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详细资料请参考：on
http://product.bio1000.com/100074/
转染
几种细胞转染技术原理和特点分析
转染方法的选择对实验结果影响很大,不少转染方法都需对细胞数量,DNA与转染试剂比例,培养及检测时间进行优化.传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下表：转染方法原理应用特点磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染\x0d瞬时性转染不适用于原代细胞\x0d操作简便但重复性差\x0d有些细胞不适用DEAE-右旋糖苷法带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复\x0d但对细胞有一定的毒副作用\x0d转染时需除血清电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入稳定转染瞬时性转染所有细胞适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大,需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件病毒介导法通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等逆转录病毒 特定宿主细胞但携带基因不能太大细胞需处分裂期\x0d需考虑安全因素腺病毒通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中瞬时转染\x0d特定宿主细胞可用于难转染的细胞\x0d需考虑安全因素阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染所有细胞适用性广,转染效率高,重复性好,但转染时需除血清.转染效果随细胞类型变化大Biolistic颗粒传递法将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达瞬时性转染可用于：人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶细胞核稳定转染\x0d瞬时性转染转染细胞数有限\x0d多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞 除上述传统方法外,近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便,对细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐.其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI) 的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂.聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体.这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低.大量实验证明,PEI是非常有希望的基因治疗载体.目前在设计更复杂的基因载体时,PEI 经常做为核心组成成分.线型PEI(Line PEI,LPEI) 与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI(Branched PEI,BPEI) 要早一些,过去的研究认为在不考虑具体条件,LPEI/DNA 转染复合物的细胞毒性较低,有利于细胞定位,因此与BPEI相比应该转染效率高一些.但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率,但同时细胞毒性也增大.超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基,在染实验中发现这种PEI的毒性低,但转染效率却较高.GenEscort 是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI 与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联,合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物.
细胞转染原理
细胞 转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。简介转染 ，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。方法脂质体转染法阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成 DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。常用细胞类型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。电穿孔转染法电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔。当遇到某些脂质体转染效率很低或儿乎无法转入时建议用电穿孔法转染。一般情况下，高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。现在针对细胞死亡开发出了一种电转保护剂，可以大大的降低细胞的死亡率，同时提高电穿孔转染效率。病毒感染对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒感染，此法可以快速100%感染，检测成功率高。
原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?
一、概念不同1、原代细胞：指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。2、传代细胞：适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。二、来源不同1、原代细胞：指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。2、传代细胞：幼年动物的肾、肺、肝、卵巢、上皮、肌肉与肿瘤等组织的细胞。三、培养步骤不同1、原代细胞：将动物组织从机体中取出离散成单个细胞(常用胰蛋白酶)，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。2、传代细胞：原代细胞基础上通过胰酶等物质消化后继续用于细胞培养的细胞，它与原代细胞具有相同核型。这类细胞在体外可以无限制分裂。参考资料来源：百度百科-传代细胞参考资料来源：百度百科-原代细胞
原代细胞和传代细胞培养有哪些区别
原代细胞和传代细胞培养有含义、培养过程、培养结果和应用四个方面区别：1、含义不同原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，也称初代培养。原代培养是将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。有几方面含义：原代培养中的代并非细胞的代数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞。传代培养是指需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养的过程。2、培养过程不同原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及生长环境的无菌。传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。取出长成单层的原代培养细胞，倒掉瓶内培养液，加入消化液。细胞变圆，相互之间不再连片时将消化液倒掉，加入新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。 3、培养结果不同原代培养细胞会分裂。原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。传代培养一般传到40到50代。一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2到4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。4、应用不同原代细胞培养为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，来帮助选择最有效的化疗方案。传代培养主要应用在医学领域，如口腔医学领域重新构建结构复杂的牙根，还有改良羊水细胞培养技术，可多次获得有效地细胞克隆，大大提高培养成功率，增加了可分析核型数量，提高了产前诊断工作的质量和效益。参考资料来源：百度百科-原代培养参考资料来源：百度百科-传代培养
为什么原代培养的细胞难转染？适合原代细胞转染的方法有哪些？
对原代培养的细胞，可以采用一下方法：
非病毒载体，选择比较好的转染试剂，推荐QIAGEN的superfect转染试剂，对原代细胞还可以。
采用电转。理论上任何细胞都可以通过电转，不足之处：需要电转仪器，缓冲液非常有讲究，不同细胞条件要自己摸索，细胞电转后，状态很不好。
DEAE-葡聚糖：这是早在1965年出现的转染方法。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克，也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染，可重复性好，转染时要除掉血清。
磷酸钙共沉淀转染：最早在1973年开始采用。氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要，pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响，重复性不佳。此法较易得到稳定转染，但转染原代细胞比较困难。
电穿孔法：通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内的。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡率高。每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。
脂质体法：中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。脂质体法始于1987年，此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对不同的细胞可能会干扰细胞的代谢。
非脂质体的脂质：新一代的脂质体技术，其与DNA结合形成胶束结构而非简单的双层膜结构，使DNA的传递更有效且细胞毒性明显降低。
活化的树状聚合物：该聚合物的高度树状分枝形成球形结构，借助每个球体无数活化的氨基末端凝聚在DNA上形成较为致密的结构，并吸附在细胞膜上，经内吞进入细胞。活化的氨基可以调节胞内溶酶体pH值，抑制降解活性，使DNA稳定存在。转染效率高，毒性低，可重复性好。血清的存在能显著提高转染效率。
病毒介导的感染：感染需要将目的基因克隆到特定的病毒体系中，经过包装细胞的包装得到改造后的病毒，再进行感染。优点是转染效率特别高，尤其是难以转染的原代细胞、活体细胞。
原代细胞构建稳定细胞株需要什么条件？
转染 24 小时后，细胞被消化并计数。将细胞植入 96 孔板中，以确保每孔 2－3 个细胞，从而获得单克隆。细胞粘附在壁上后，添加抗生素进行筛选。筛选时间和浓度取决于细胞。通常，G418 生效一周，嘌呤 2－3 天。脂质体单克隆的筛选时间长且效率低，仅约 1％。病毒转染， 首先包装细胞，通常是 293 个细胞，以包装病毒，然后用病毒转染靶细胞。包装病毒取决于不同类型的病毒，一般需要 3－5 天，应测量包装病毒的滴度，并根据滴度确定转染靶细胞的病毒量，在转染靶细胞后 1－2 天，通过抗生素筛选稳定的细胞系。转染获得稳定细胞系的效率高，但步骤繁琐。目前，许多公司提供构建稳定细胞系的技术服务，如杭州那边的波因，南京的凯基那样，他们可以为各种载体和细胞系的构建提供一整套技术服务。它是脂质体转染后克隆和筛选的稳定细胞系，另一种是利用逆转录病毒和慢病毒转染来筛选稳定的细胞系，通过蛋白酶或其他方法从人体组织，如人体组织里面的小鼠组织，大鼠组织，兔组织等， 和体外模拟体培养获得的细胞，他们被称为原代细胞，一般认为第一代培养的原代细胞和传给第 10 代的细胞统称为原代细胞培养。使其原代细胞在人工条件下存活，生长，繁殖和传递，研究细胞生命过程，细胞癌变，细胞工程等问题。通过选择方法或克隆形成方法从原代培养细胞中获得的具有特殊性质的细胞或标记物称为细胞系，一般认为，细胞系是通过单细胞隔离培养或筛选，由单细胞增殖形成的细胞群。
什么是原代细胞，细胞株，细胞系
什么是原代细胞，细胞株，细胞系
原代培养 通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，
原代的细胞到底能不能够构建稳定的细胞株呢？
原代细胞要建立稳定的细胞系，必须满足一定的条件。转染24小时后，细胞消化计数。将细胞植入96孔板，保证每孔2-3个细胞。细胞贴壁后，加入抗生素进行筛选。筛选时间和浓度取决于细胞。一般来说，G418起效一周，嘌呤2-3天。脂质体单克隆抗体筛选时间长，效率仅为1%左右。病毒转染，首先包装细胞，通常是293个细胞，包装病毒，然后用病毒转染靶细胞。包装病毒取决于不同类型的病毒，一般需要3-5天。测定包装病毒的滴度，根据滴度确定病毒转染靶细胞的量。转染后1-2天用抗生素筛选稳定的细胞株。转染效率高，但步骤复杂。目前，许多公司为稳定细胞系的构建提供技术服务，如杭州博恩、南京凯基等。它们可以为各种载体和细胞系的构建提供一整套技术服务。脂质体转染后克隆筛选出稳定的细胞株。二是通过逆转录病毒和慢病毒转染筛选稳定的细胞株。它可以通过蛋白酶或其他方法从人体组织中获得，如小鼠组织、大鼠组织、兔组织等，称为原代细胞。一般认为，在第一代培养的原代细胞和转移到第十代的细胞统称为原代细胞培养。使原代细胞在人工条件下存活、生长、增殖和转移，研究细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题。通过选择或克隆形成方法从原代培养细胞中获得具有特殊性质的细胞或标记物称为细胞系。一般认为细胞系是单个细胞通过分离培养或筛选而形成的细胞群。总而言之，实验环境稳定，温度适宜，原代细胞健康。在满足这些条件后，再等待一段时间，即可进行栽培，这样才可以构建稳定的细胞株。
