最简洁易懂讲sanger测序
桑格测序法，又称双脱氧链终止反应，与 化学降解法 以及其衍生方法统称为第一代 DNA测序 技术，为 人类基因组计划 所使用主要测序方法，人类基因组中用的是基于sanger法的半自动测序仪。其原理是测序反应的核心就是利用ddNTP（由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力），这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。
其测序步骤如下：
首先，将待测序的DNA扩增，就是复制出很多相同的DNA，准备足够的样本量。↓
接下来，加热，使DNA变性。双链DNA就分离开来，成为单链DNA，只留下下面的单链，称为模板链。↓
将测序引物（primer）和模板链结合，从模版连的3’位置开始（图片中应该是反了，后面图片都是反的，感谢 徐鑫 指正！），加入引物是因为DNA聚合酶不能重头复制需要前面有一小段起点。（感谢阿敲指正！）↓
然后将添加完测序引物的DNA平均分散在四个反应容器中。为什么是四个？因为DNA由4个碱基组成，分别是：A、T、G、C。↓
接下来，将DNA聚合酶加入到所有四个反应容器中。↓
继续添加佐料，将四个基本碱基的原料（dNTP），这些原料还是单个的脱氧核糖核酸，加入到每个反应容器。↓
接下来，关键步骤来了，加入特异性ddNTP到反应容器，每个反应容器中只加入一种ddNTP。这里有点复杂，要说一下，什么是特异性ddNTP。ddNTP就是一种变异过的碱基，也有四种，我们姑且称为A*，T*，G*，C*，他也可以和对应的碱基结合，A*-> T, T*-> A, G*->C, C*->G。但是和普通碱基不同的是，当他们和对应碱基结合后，可以终止后续的其他结合，就是DNA的链式反应就结束了。这样就产生很多一边完整（模板单链），一边不完整（因为ddNTP的存在）的DNA分子。如下图，分别加入不同的ddNTP后↓
以黄色的为例，比如这个黄色容器代表加入ddATP（A*）。↓
因为有DNA聚合酶，还有碱基原料，还有特殊碱基A*，在这个容器内开始DNA聚合反应。↓
聚合酶将各个碱基连接到模板链上，直至特殊的A*碱基（带尾巴的黄色块）和绿色块T碱基配对，然后聚合反应终止。这里大家要问了，为什么不和前面的两个绿色结合，直接终止呢？这里要说一句，这里的结合是随机产生的，所以，有一些运气好，直接就和第一个绿色块结合，然后终止了。有些就和第二个绿色块结合，有些就和后面的绿色块结合，反正因为样本足够，按照概率来说，每个对应的绿色块都会有机会和特殊A*碱基配对。下图只是其中一种情况。↓
其他的容器内也在发生相类似的反应。等到反应结束后，将这四个容器内的产物，放置到电泳胶上。↓
通电↓
由于其磷酸盐主链赋予的负电荷，DNA从负极开始迁移，较小的较轻长度的DNA进一步迁移到电泳板的底部。刚刚我们提到过，由于ddNTP随机结合的位置不同，形成的不完整DNA分子，这里不同的DNA分子就被区分出来了，并且分布在不同的位置上。通过荧光标记的方法，就会在胶片上留下记号。↓
转自
https://zhuanlan.zhihu.com/p/29270914
https://zh.wikipedia.org/wiki/%E6%A1%91%E6%A0%BC%E6%B5%8B%E5%BA%8F
第三代基因测序技术
问题一：第三代测序技术的第三代测序技术原理 第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物(Helicos)的SMS技术和美国太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。
问题二：什么是第三代基因测序技术 go the wrong way
问题三：第三代测序技术的第三代测序技术特点 1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。2、它实现了DNA聚合酶内在自身的延续性，一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。3、它的精度非常高，达到99.9999%。4、直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。5、第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。
问题四：第三代测序技术的介绍 第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。
问题五：DNA 的 1代测序，2代测序，3代测序的区别是什么啊？ 第一代指双脱氧末端终止法，扩增后通过毛细管电泳读取序列，每次获取数据量少
第二代为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa，solid，高通量，可一次获得数G数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。
第三代特点是单分子测序，多基于纳米科技，无需扩增，对单分链DNA/RNA直接用合成、降解、通过纳米孔等方式直接测序，核心特点是无需扩增所以成本更低
问题六：第三代测序技术的第三代测序平台比较 测序方法/平台 公司 方法/酶 测序长度 每个循环的数据产出量 每个循环耗时 主要错误来源 第三代测序技术 Heliscope/Helicos Genetic Analysis System Helicos 边合成边测序 /DNA聚合酶 30-35 bp 21-28 Gb 8 d 替换 SMRT Pacific Biosciences 边合成边测序 /DNA聚合酶 100000 bp 纳米孔单分子 Oxford Nanopore 电信号测序 /核酸外切酶 无限长
问题七：基因三代测序是什么？ 三代测序是 DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基(dNTP)，在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个 DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要与酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。PacBio SMRT技术的一个关键是将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW(零模波导孔)原理：在一个反应管(SMRTCell：单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔，即 ZMW(零模波导孔)外径 100多纳米，比检测激光波长小(数百纳米)，激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。（中源-协-和-基因）
